환형동물(지렁이) 열수 추출물의 면역활성 효과

본 실험에서 사용한 환형동물(지렁이)은 ㈜에스웜(Korea)으로부터 동결건조분을 구입하여 사용하였다. 동결건조된 환형동물을 실험용 분쇄기(NSG-1002SS, Hanil, Korea)로 분쇄한 분말 2 g에 증류수를 100 mL첨가하여 60℃에서 24시간 동안 가열하여 추출하였다. 원심분리기(Combi-514R, Hanil, Korea)를 이용하여 3,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 분리하여 추출물로 사용하였다. 실험동물은 6주령(18-20 g)의 C57BL/6 웅성 마우스를 Orient사(Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 분양받은 마우스는 동물사육실 내부 환경에 1주간 순화시킨 후 미분화 골수 세포 및 비장세포를 채취하기 위하여 사용하였다.

C57BL/6마우스로부터 골수 채취용 주사기(BD, USA)를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 차가운 phosphate buffered saline(PBS; Invitrogen Co., USA)으로 3회 세척한 후, 적혈구를 제거하기 위하여 red blood cell(RBC) lysis buffer(Invitrogen Co., USA)를 5 mL 처리하여 10분간 방치하였다. PBS로 3번 세척하여 적혈구 찌꺼기를 완전히 제거하였다. 분리한 미분화 골수세포를 대식세포로 분화시키기 위하여 10% Fetal bovine serum(FBS; GIBCO, USA)이 포함된 Dulbeco’s Modified Eagle’s medium(DMEM; Life Technology, USA)에 2 mM L-glutamin, 100 unit/mL penicillin/streptomycin, 50 μM mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid, 1 mM sodium pyruvate, 25 ng/mL macrophage colony-stimulating factor(MC-SF; R&D System, USA)를 첨가하여 4일 동안 배양하였다.

환형동물 추출물의 처리가 대식세포의 세포 증식능(cell proliferation)에 미치는 영향에 관하여 측정하기 위하여 마우스 골수세포로부터 분화된 대식세포를 각각 96 well plate에 well당 3×10⁵개로 분주한 후, 환형동물 열수 추출물을 62.5, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL의 농도로 처리하여 37℃로 유지되는 5% CO₂ 세포 배양기에서 24시간 배양한 후, MTT 방법에 의하여 세포 증식능을 평가하였다. MTT 방법은 3-(4,5dimethylthiazol-2yl)- 2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT; Sigma Chemical Co., USA) 시약을 phosphate buffered saline(PBS; Invitrogen Co., USA)에 5 mg/mL의 농도로 용해하여 well당 30 μL씩 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 배양 상등액를 제거하고, 세포 내 생성된 formazan crystal을 dimethyl sulfoxide(DMSO; Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 microplate reader를 이용하여 흡광도 570 nm에서 측정하였다. 세포증식율은 Control(medium only)의 흡광도 값을 기준으로 비교하였다.

환형동물 추출물의 처리가 대식세포의 사이토카인 분비능에 미치는 영향을 측정하기 위하여 마우스 골수세포로부터 분화된 대식세포를 48 well plate에 well당 5×10⁵개로 분주한 후, 농도별(62.5 및 125 μg/mL) 환형동물 추출물을 처리하여 37℃로 유지되는 5% CO₂ 세포 배양기에서 24시간 배양한 후, 배양 상등액에 포함되어있는 tumor necrosis factor(TNF)-α, interleukin(IL)-6, 및 IL-1β의 함량을 측정하였다. 사이토카인의 함량은 enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) kit(BD Biosciences, USA)를 사용한 후 microplate reader를 이용하여 흡광도 450 nm에서 측정하였다.

환형동물 추출물의 처리가 대식세포 표면 활성인자의 발현에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 마우스 골수세포로부터 분화된 대식세포를 각각 6 well plate에 well당 1×10⁶개로 분주한 후, 농도별(62.5 및 125 μg/mL) 처리한 후 24시간 동안 반응시키고, 각각의 세포를 회수하였다. 항체의 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 회수된 각각의 세포에 1 μg/mL의 Fcγ I/III(BD Biosciences, USA)을 처리하여 4℃에서 20분간 방치한 후, 대식세포와 수지상세포 표면 활성인자 분석을 위하여 anti-CD80-PE 및 anti-CD86-PE(BD Biosciences, USA)와 같은 세포 표면 항체를 각각 1,000배 희석하여 각각의 세포에 처리하고 30분 동안 방치한 후, 유세포 분석기(BD FACSVerse^TM; BD Biosciences)를 이용하여 환형동물 추출물의 처리가 대식세포의 세포 표면 활성인자의 발현에 미치는 영향에 관하여 분석하였다. 분석 후에 나온 데이터는 FlowJo software(Tree Star, USA)를 사용하여 평가하였다.

1주간의 순화를 마친 마우스를 경추 탈골법으로 희생시킨 후 비장을 무균적으로 적출하여 10%의 FBS와 항생제 penicillin과 streptomycin (100 unit/mL, 100 μg/mL)을 함유한 Roswell park memorial institute(RPMI)-1640(Life Technology) 배지로 세척한 후 tissue grinder(Corning costar, USA)로 균질화하여 비장세포를 유리시켰다. 세포현탁액에 적혈구를 제거하기 위하여 red blood cell(RBC) lysis buffer(BD Biosciences, USA)를 첨가하여 적혈구를 제거하였고, 혈구계수기를 이용하여 세포수를 측정하였다.

환형동물 추출물의 처리가 마우스로부터 분리한 비장세포의 증식능에 미치는 영향에 관하여 알아보기 위하여, 96 well plate에 well당 1×10⁶개의 비장세포를 분주한 후, 환형동물 열수 추출물을 62.5, 125, 250, 500, 1000 μg/mL의 농도로 처리하여 37℃로 유지되는 5% CO₂ 세포 배양기에서 24시간 배양한 후, WST-1^®(Daeil Lap Science, Korea) 용액을 각각의 well에 10 μL씩 첨가하고, 2시간 동안 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 흡광도 450 nm에서 측정하여 세포 증식능을 평가하였다. 비장세포 증식율은 Control(medium only)의 흡광도 값을 기준으로 비교하였다.

환형동물 추출물의 처리가 비장세포의 사이토카인 분비능에 미치는 영향에 관하여 알아보기 위하여, 비장 조직으로부터 분리된 비장세포를 48 well plate에 well당 2×10⁶개씩 분주한 후, 농도별(125 및 250 μg/mL) 환형동물 추출물을 처리하여 각각 24시간 동안 반응시키고, 배양 상등액에 존재하는 사이토카인[interferon(IFN)-γ 및 interleukin(IL)-4]의 함량에 관하여 측정하였다. 사이토카인의 측정은 enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) kit(eBioscience Co., USA)를 사용한 후 microplate reader를 이용하여 흡광도 450 nm에서 측정하였다.

이상의 실험에서 얻어진 결과는 통계학적 소프트웨어(GraphPad Prism Software, version 4.03; GraphPad Software, USA)를 사용하여 Tukey’s multiple comparison test에 이어 one way ANOVA test로 분석하였으며, 시료 간의 유의성은 Duncan's multiple range test로 ^*p<0.05, ^**p<0.01 및 ^***p<0.001 수준에서 비교하였다.

환형동물 추출물의 처리가 대식세포의 세포 증식능에 미치는 영향에 관해 평가하기 위하여 C57BL/6 마우스로부터 미분화 골수 세포를 분리하여 대식세포로 분화시킨 후, 분화된 대식세포에 농도별(62.5, 125, 250, 500, 및 1,000 μg/mL)로 추출물을 처리하였을 때의 대식세포의 세포 증식능을 Fig. 1에 나타냈다. 환형동물 추출물을 농도별로 처리한 결과, 지렁이 추출물 처리구에서 250 μg/mL이상의 농도에서 유의적으로 대식세포에 독성이 관찰되었다. 본 연구 결과에서 지렁이 추출물의 처리구의 경우 고농도에서 세포독성을 나타내었는데, 이러한 세포독성을 나타내는 이유는 지렁이의 내부에 축척하고 있는 metallothioneins의 함량과 밀접한 관련을 갖는 것으로 사료되며, metallothionein는 금속(카드뮴, 아연, 구리)과 결합하는 단백질로서 다량의 중금속 성분을 축척할 수 있는 구조를 가지고 있기 때문에 세포 독성이 증가한 것으로 사료된다.

Fig. 1. Macrophage proliferation activity of water extracts from annelida (Lumbricus rubellus). The sample was treated at the concentration of 62.5, 125, 250, 500, and 1,000 μg/mL in bone-marrow derived macrophages (BMDMs). The data shown are the mean ± SD of at least three experiments. ^*p<0.05 and ^**p<0.01 was compared with un-treated sample group.

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생체면역조절 기능이란 외부로부터 자기 자신을 보호하기 위해 사용되는 생물체의 자기방어 수단으로, 면역계는 침입한 항원에 대하여 활성화되는 각종 면역세포들의 작용으로 숙주를 방어한다(Kim et al., 2005). 이러한 면역세포들의 증식, 분화 및 작용기전은 다양한 종류의 외부자극에 의해 조절될 수 있다고 보고되고 있다(Kwon et al., 2001; Suh, 1996). 이런 관점에서 질병상태는 면역 반응이 저하된 상태라고 전제하고, 암 환자 또는 노약자 등에서 면역능을 증진시킬 수 있는 물질을 추구하게 되었다. 다양한 인체의 면역세포들 중에서 외래 병원체가 생체로 유입되었을 때 가장 먼저 감지하는 세포가 탐식세포(phagocyte)이고, 이들은 선천면역체계의 중추적인 역할을 담당한다(Cha and Lim, 2014). 탐식세포의 주된 역할은 외래 항원의 감시 및 이동, 항원의 탐식 및 제거 등이 있으며, 항원제시세포로써 후천면역계를 매개하는 T 세포와 상호작용을 일으켜, T 세포의 활성을 돕고, 조절하는 역할을 수행하므로(Ripoll et al., 2008) 탐식세포들의 활성을 조절하는 것은 면역관련 질병들의 예방 및 치료에 관한 무한한 가능성을 제시한다.

병원성 항원들이 인체 내 유입되면 다양한 면역세포이 자기방어 기작을 수행하기 위하여 활성화된다. 일차적으로 탐식세포(대식세포 및 수지상세포)들이 활성화되면서 부착성이 강해지며, 외부 바이러스나 세균에 오염된 세포를 직접적으로 탐식하여 사멸시키거나, 간접적으로 면역활성 물질인 사이토카인을 생산한다(Lee et al., 2012). 사이토카인은 면역세포간의 상호협력을 중재하는 역할을 수행하며, 기타 외부에서 오는 여러 가지 자극에 대하여 한 개체의 세포와 조직들이 유기적으로 작용하도록 도와줄 뿐만 아니라, 조혈작용, 면역반응, 일반적인 염증과정 등을 조절하는 것으로 보고되어진다(Calixto et al., 2004). 대식세포와 수시상세포가 생산하는 대표적인 사이토카인으로 tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin(IL)-1β 및 IL-6 등이 있으며(Calixto et al., 2004), 이들은 대식세포의 활성화를 알아보기 위한 중요한 지표로 판단된다.

본 연구에서 환형동물 추출물의 처리가 대식세포의 활성화에 미치는 영향에 관해 관찰하기 위하여 활성화된 대식세포의 주요한 지표 물질 중 대표적인 사이토카인 분비능 조절에 관하여 알아보았다. 지렁이 추출물 세포독성 평가시 250 μg/mL이상의 농도에서 세포독성이 나타나는 것으로 판단되어 62.5 및 125 μg/mL의 농도로 처리하여 처리 농도별 사이토카인 분비능을 관찰하였다(Fig. 2). 또한, 양성 대조구로써 대식세포의 마이토젠(mitogen)인 lipopolysaccharide(LPS)를 사용하여 환형동물 추출물과 결과를 비교하였다. 그 결과, 추출물 처리구에서 처리 농도가 증가할수록 사이토카인의 분비능이 농도 의존적으로 증가되는 것이 관찰되었다. 따라서 환형동물 추출물이 대식세포 활성화 지표물질인 사이토카인의 분비능을 상승시키는 것을 확인하였고, 이러한 환형동물 추출물이 대식세포 활성화에 주는 영향을 직접적으로 평가하기 위하여 대식세포 표면에 부착된 세포 표면 활성인자(cell surface activation marker) 중 대표적으로 알려진 세포 표면 항원무리[cluster of differentiation (CD)] molecule의 발현에 관하여 관찰하였다.

Fig. 2. Cytokine (TNF-α, IL-6, IL-1β) production activity of water extracts from annelida (Lumbricus rubellus) in macrophage. Extract was treated at the concentration of 62.5 and 125 μg/mL, and LPS was also treated at the concentration 0.2 μg/mL in BMDMs. The data shown are the mean ± SD of at least three experiments. ^**p<0.01 and ^***p<0.001 was compared with un-treated sample group (UN).

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세포 표면 항원무리[cluster of differentiation (CD)]는 세포 표면 분자를 식별하고 연구하기 위해 붙인 이름으로(Chan et al., 1988), 다양한 면역세포를 분리 또는 분석할 수 있으며, 세포의 수용체나 수용체를 활성화하는 리간드로 작용하는 등 면역세포 활성화에 중요한 지표로 사용되고 있다(Kikuchi et al., 2002; Kim et al., 2007).

본 연구에서는 환형동물 추출물의 처리가 대식세포의 세포 표면 활성인자인 CD80 및 CD86의 발현에 미치는 영향을 유세포 분석기를 이용하여 알아보았다. 지렁이 추출물(62.5 및 125 μg/mL) 및 LPS(0.2 μg/mL)를 처리하여 처리 농도별 CD 80, 86 발현 정도를 관찰하였다(Fig. 3). 그 결과, 대식세포의 표면 활성 인자들의 발현이 처리 농도에 의존적으로 증가되는 것이 관찰되었다. 따라서 사이토카인의 분비능 증가(Fig. 2)와 세포 표면 활성인자의 발현 증가(Fig. 3)로 보아, 환형동물 추출물의 처리는 선천 면역세포인 대식세포의 활성화에 크게 기여하는 것으로 사료된다. 추후 이러한 면역활성 효과에 관하여 보다 면밀히 알아보기 위하여 적응면역계의 대표적인 기관인 비장(spleen)으로부터 비장세포(splenocyte)를 분리하여, 분리된 비장세포에 환형동물 추출물의 처리하여 비장세포의 세포증식 및 사이토카인 생성능에 미치는 영향에 관하여 관찰하였다.

Fig. 3. Cell surface marker (CD80/86) expression of water extracts from annelida (Lumbricus rubellus) in macrophage. Extract was treated at the concentration of 62.5 and 125 μg/mL, and lipopolysaccharide (LPS) was also treated at the concentration 0.2 μg/mL in BMDMs. The data shown are the mean ± SD of at least three experiments.

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환형동물 추출물의 처리가 비장세포의 세포 증식능에 미치는 영향에 관하여 관찰하기 위하여, C57BL/6 마우스로부터 비장조직을 적출하고, 분리된 비장조직으로부터 비장세포를 유리시켜, 환형동물 추출물을 농도별(62.5, 125, 250, 500, 및 1,000 μg/mL) 처리하였을 때의 비장세포의 세포 증식능을 Fig. 4에 나타냈다. 환형동물 추출물을 농도별로 처리한 결과, 추출물 처리구에서 500 μg/mL이상의 농도에서 유의적으로 비장세포에 대한 세포독성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 지렁이 추출물의 대식세포에 대한 세포 증식능과 유사하게 고농도에서 세포독성을 나타내었다.

Fig. 4. Splenocyte proliferation activity of water extracts from annelida (Lumbricus rubellus). Extract was treated at the concentration of 62.5, 125, 250, 500, and 1,000 μg/mL in splenocytes separated from mouse. The data shown are the mean ± SD of at least three experiments. ^*p<0.05 and ^**p<0.01 was compared with un-treated sample group.

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선천면역체계가 외래항원에 대한 보호 기작을 발동하여 활성화가 되면 탐식세포들의 활성화가 일어나고, 이러한 탐식세포들은 적응면역계에 이러한 신호를 전달하게 된다(Calixto et al., 2004). 적응면역계를 담당하는 주된 생체기관은 비장으로써, 혈액에서부터 유래되는 외래항원에 대하여 주된 보호 면역을 수행하며, B 및 T 림프구의 성숙과 분화가 이루어지는 기관으로 면역시스템에서 매우 중요한 역할을 수행한다(Calixto et al., 2004). 비장에 존재하는 면역세포의 분포를 보면 T세포가 70% 이상을 차지하며, 나머지는 B 및 대식세포들이 차지한다. 따라서 면역 증강물질이 면역활성을 유도하는지를 확인하는 데 있어서, 면역 T세포와의 반응을 관찰하기 위하여 비장세포 모델을 주로 사용한다(Ryu et al., 2006). 면역 T 세포는 사이토카인과 일부 전사인자(transcription factor)들의 활성화에 의하여 Th1 세포와 Th2 세포로 분화하며, 각각의 세포에서 분비되는 사이토카인의 경우 면역증강이나 알레르기 유발에 밀접한 관련이 있다고 보고되어진다(Shan et al., 1999). Th1 세포가 분비하는 대표적인 사이토카인으로는 IL-2, IFN-γ, TNF-α등이 있고, Th2 세포가 분비하는 대표적인 사이토카인으로는 IL-4, 5, 10, 13이 있으며, 특히 Th1 세포가 분비하는 사이토카인이 증가할 경우 면역활성에 밀접한 관련이 있다고 판단하며, Th2 세포가 분비하는 사이토카인이 증가할 경우 알레르기 질환이나 아토피 질환의 유발과 밀접한 상관관계가 있다고 보고되어진다(Medzhitov, 2001; Wang et al., 2001).

본 연구에서도 환형동물 추출물의 처리가 비장세포의 사이토카인 분비 특성에 미치는 영향에 관한 것을 알아보기 위하여, 비장조직으로부터 유리된 비장세포에 농도별(125 및 250 μg/mL) 환형동물 추출물 처리하였을 때의 비장세포 사이토카인 분비능을 Fig. 5에 나타냈다. 게다가 양성 대조구로써 면역 T세포의 마이토젠(mitogen)인 Concanavalin(Con A)를 사용하여 환형동물 추출물과 결과를 비교하였다. 사이토카인 분비능 실험결과, 환형동물 추출물 처리구에서 Th1 세포가 분비하는 사이토카인인 IFN-γ의 분비가 증가되었으며, Th2 세포가 분비하는 사이토카인인 IL-4의 분비량에 대한 변화는 나타나지 않았다. 이러한 결과로 미루어 보아, 환형동물 추출물의 처리는 알레르기나 아토피 등의 질병 유발과 밀접한 관련이 있는 Th2 세포의 활성화에는 영향을 주지 않으며, 면역활성과 밀접한 관련이 있는 Th1 세포의 활성화를 유도하여 면역활성을 증강시키는 것으로 사료된다.

Fig. 5. Cytokine production (IFN-γ and IL-4) activity of water extracts from annelida (Lumbricus rubellus) in splenocyte. Extract was treated at the indicated doses (125 and 250 μg/mL) in splenocytes separated from mouse. The data shown are the mean ± SD of at least three experiments. ^*p<0.05 and ^***p<0.001 was compared with un-treated sample group (UN). ^n.s. indicates no significant effect.

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